2022年1月20日，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞中心遺傳學(xué)系Bilal Cakir教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊在《nature communication》上發(fā)表了一篇研究報告，報告表明研究人員開發(fā)了一種從人類胚胎干細(xì)胞 (hESCs) 誘導(dǎo)生成人類皮質(zhì)類器官 (hCOs) ，進(jìn)而產(chǎn)生功能性小膠質(zhì)細(xì)胞（即含小膠質(zhì)細(xì)胞的 hCOs ，mhCOs）的方法。在功能上，mhCOs 中的小膠質(zhì)細(xì)胞可以保護(hù)神經(jīng)元免受 Aβ 沉積引起的細(xì)胞和分子損傷；在科研上，這個方法可用于基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究，開發(fā)研究小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病中作用的體外模型。
小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中的常駐巨噬細(xì)胞。它們的主要功能是在大腦中進(jìn)行免疫監(jiān)視，并通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活、突觸形成、凋亡細(xì)胞消除和程序性細(xì)胞死亡來促進(jìn)大腦網(wǎng)絡(luò)的形成。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞功能受損與神經(jīng)發(fā)育（即自閉癥或精神分裂癥）和神經(jīng)退行性疾?。窗柎暮Ｄ。珹D）之間存在密切聯(lián)系。因此，研究這些疾病下小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，必須開發(fā)對應(yīng)的研究模型，模擬人腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的功能。
3D大腦類器官技術(shù)提供了一個研究人類大腦如何發(fā)展和經(jīng)歷神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性方案。通過小分子誘導(dǎo)或基于多功能干細(xì)胞 (PSC) 的內(nèi)在神經(jīng)外胚層分化可生成腦類器官。然而，大多數(shù)神經(jīng)外胚層分化產(chǎn)生的腦類器官不包含中胚層細(xì)胞，例如小膠質(zhì)細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞只能從 hESC 分化或從原代組織中分離出來，與腦類器官共培養(yǎng)以研究其功能?？傮w而言，以高度可重復(fù)的方式在腦類器官中產(chǎn)生小膠質(zhì)細(xì)胞，對于了解這些細(xì)胞在人腦中的功能以及剖析它們在疾病狀態(tài)中的作用具有重要意義。
之前的研究表明，一種被稱為 Pu.1的 ETS轉(zhuǎn)錄因子對于將細(xì)胞發(fā)育成骨髓細(xì)胞（包括小膠質(zhì)細(xì)胞）至關(guān)重要， Pu.1 的過表達(dá)可將各種細(xì)胞類型重新編程為骨髓細(xì)胞。研究人員檢查了hCOs中 PU.1 誘導(dǎo)的細(xì)胞是否可以分化為功能性小膠質(zhì)細(xì)胞。共測試了兩種方案：胚狀體（EB）分化和神經(jīng)元分化（如圖1a，b）。在這兩種情況下，5 天的 PU.1 誘導(dǎo)明顯增加了小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如IBA1）和 SALL1抗體的表達(dá)。但調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞存活，分化和增殖的集落刺激因子1（如Csf1r，Cd115）以及其他小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如Tmem119，P2ry12）的表達(dá)沒有增加（如圖1c）。小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的有限誘導(dǎo)很可能是由PU.1 的短暫引入和下調(diào)相關(guān)體外環(huán)境造成的。IBA1的免疫染色結(jié)果（IF）進(jìn)一步揭示了在EB或神經(jīng)元分化的條件下過表達(dá)PU.1 5天的分化細(xì)胞中含有小膠質(zhì)細(xì)胞（如圖1d）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，在神經(jīng)外胚層分化條件下，PU.1 過表達(dá)會誘導(dǎo) hESC 分化為骨髓細(xì)胞。
研究人員進(jìn)一步測試了發(fā)育中的皮質(zhì)類器官中 PU.1 的過表達(dá)是否可以誘導(dǎo)生成小膠質(zhì)細(xì)胞。由于小膠質(zhì)細(xì)胞占成熟腦細(xì)胞的 5-15%，研究員將 10% 的 PU.1 感染的 BC4 hESC 與 90% 的親本 hESC 混合以產(chǎn)生 hCOs（圖 1a）。hCOs 的 3D 實時成像揭示了 GFP+ 細(xì)胞在 30 天的 hCOs 處具有變形蟲細(xì)胞形狀的組織（如圖 1e）。與 30 天齡的 hCOs 相比，70 天齡的 hCOs 包含更多數(shù)量的變形蟲細(xì)胞形狀的細(xì)胞（如圖 1e）。與共聚焦成像一致，PU.1 誘導(dǎo)的 hCOs 在第70天表現(xiàn)出較多的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)（如圖 1b）。此外，PU.1 誘導(dǎo)的 hCOs 顯示小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 Iba1、Csf1r、Cd11b、Cx3cr1、Tmem119 和 P2ry12 的表達(dá)增加（如1b）。這些結(jié)果表明PU.1 過表達(dá)的 hCOs 含有小膠質(zhì)細(xì)胞,研究人員將這些類器官命名為含有 hCOs (mhCOs) 的小膠質(zhì)細(xì)胞。
圖片來源于《Expression of the transcription factor PU.1 induces the generation of microglia-like cells in human cortical organoids》
為了研究在 mhCOs 中由 PU.1 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞是否與體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞具有相似的功能，研究人員評估了30、70或90天大的mhCOs 中的小膠質(zhì)細(xì)胞特征。研究發(fā)現(xiàn)在第70天，22%的小膠質(zhì)細(xì)胞同時表達(dá)IBA1和MKI67，表明存在增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞（如圖1g）；共免疫染色結(jié)果揭示了 IBA1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在 PSD95，表明功能性小膠質(zhì)細(xì)胞存在吞噬或接觸 mhCOs 中神經(jīng)元的突觸結(jié)構(gòu)（如圖1h）；基于用單分子 RNA 熒光原位雜交檢測神經(jīng)元活性標(biāo)志物Fos和Npas4，研究人員在第 70 天沒有觀察到 mhCOs和hCOs的神經(jīng)元活性有任何差異；研究人員進(jìn)一步證實，在第70-80天和第110-120天，hCOs和 mhCOs都含有功能性神經(jīng)元。
接下來研究人員在小鼠大腦中檢查了PU.1誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)功能是否正常。研究人員將PU.1誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞移植到有免疫缺陷的小鼠大腦中并進(jìn)行Aβ-oligo處理。移植3周后，人類特異性CD68和Aβ的免疫染色顯示，PU.1衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出復(fù)雜的分枝形態(tài)并且具有功能活性，會對寡聚Aβ產(chǎn)生反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明，PU.1 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠大腦環(huán)境中和人腦類器官中的功能相似。
作為大腦常駐骨髓細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的失調(diào)是人類大多數(shù)腦部疾病的潛在機(jī)制，包括 AD、ASD 和精神分裂癥。然而，開發(fā)體外模型來研究小膠質(zhì)細(xì)胞是一項重大挑戰(zhàn)，原發(fā)性小膠質(zhì)細(xì)胞或IPSC衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞是目前可行的方案。但研究表明，如果不考慮與大腦中其他細(xì)胞的相互作用，研究人員就無法研究小膠質(zhì)細(xì)胞的功能和相關(guān)表型。研究小膠質(zhì)細(xì)胞中的分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞反應(yīng)需要在大腦結(jié)構(gòu)的背景下產(chǎn)生小膠質(zhì)細(xì)胞研究模型。因此，研究人員開發(fā)出的mhCOs給了解人類小膠質(zhì)細(xì)胞在健康和疾病狀態(tài)下的功能提供了機(jī)會。
此次提出的mhCOs提供了一個方案，該方案可在腦類器官內(nèi)生成可調(diào)節(jié)數(shù)量的誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞，并通過單獨(dú)的小膠質(zhì)細(xì)胞或hCOs中的所有細(xì)胞的基因修飾來研究體外小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性功能。研究人員可以利用這一優(yōu)勢，結(jié)合CRISPRi來確定小膠質(zhì)細(xì)胞中與 AD 相關(guān)基因在響應(yīng)Aβ中的作用。與之前的研究相比，mhCOs不需要使用細(xì)胞因子和生長因子來誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞，且mhCOs攜帶小膠質(zhì)細(xì)胞可與人腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的位置和行為相對應(yīng)。
雖然mhCOs提供了一個獨(dú)特的方案，通過該方案和基因編輯可以研究與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，但仍然存在局限性。一是小膠質(zhì)細(xì)胞的分布在每個mhCOs內(nèi)均不同。其次，并非所有在mhCOs 中過表達(dá)PU.1的細(xì)胞都分化為小膠質(zhì)細(xì)胞簇，這表明存在轉(zhuǎn)化效率低下或環(huán)境影響細(xì)胞分化的問題。最后，mhCOs不具備內(nèi)源性血管系統(tǒng)，因此在發(fā)育后期會產(chǎn)生不健康的細(xì)胞。內(nèi)部炎癥的發(fā)生和細(xì)胞類型復(fù)雜性的缺乏可能導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過早被激活以及過早的發(fā)育成熟。盡管如此，mhCOs開辟了新的途徑來探索小膠質(zhì)細(xì)胞在人腦類器官中對各種人腦疾病和大腦發(fā)育的功能。
寧波易賽騰生物科技有限公司 李福云編譯
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