2021年9月29日，F(xiàn)abin Han教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在Frontiers in Aging Neuroscience雜志上發(fā)表了名為Current Approaches and Molecular Mechanisms for Directly Reprogramming Fibroblasts Into Neurons and Dopamine Neurons 的研究綜述，詳細(xì)闡述了當(dāng)前將成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化獲取多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)展歷史，制備方法、內(nèi)在分子機(jī)制以及轉(zhuǎn)分化神經(jīng)細(xì)胞在帕金森（PD）等神經(jīng)退行性疾病研究應(yīng)用上面臨的挑戰(zhàn)。利用合適的生物因子組合，不經(jīng)過多能干細(xì)胞階段而直接將一種類型的成熟體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為另一種類型的成熟體細(xì)胞的技術(shù)被定義為直接重編程技術(shù)，或稱為轉(zhuǎn)分化技術(shù)。目前通過直接轉(zhuǎn)分化可以獲得多巴胺能神經(jīng)元，在PD的病理機(jī)制研究以及治療方面應(yīng)用廣泛，前景良好。
研究人員發(fā)現(xiàn)，PD主要是由中腦的多巴胺神經(jīng)元（DA神經(jīng)元）的特異性退化引起的,主要生物標(biāo)志是Lewy小體的產(chǎn)生。Lewy小體主要由退化的多巴胺神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中的蛋白聚合而成。目前市場上僅有一些多巴胺替代藥物，只能延緩疾病的惡化，并不能治愈患者。因此，移植細(xì)胞以取代受損的DA神經(jīng)元在治療PD病癥方面具有巨大的潛力。
早期研究人員將人類胎兒腦源性中腦組織或fNSCs移植給PD患者，取得了一定的效果。移植的fNSCs不斷改善PD患者的癥狀，它們在一些患者的大腦中存活了16年，有的甚至達(dá)到24年以上，但使用移植細(xì)胞會產(chǎn)生倫理和免疫系統(tǒng)排斥等問題。隨后研究人員開始嘗試使用其他干細(xì)胞來治療PD，如胚胎干細(xì)胞（ESC）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和多巴胺前體細(xì)胞，但并不能解決問題。之后iPSCs的出現(xiàn)克服了免疫系統(tǒng)對于移植干細(xì)胞的排斥反應(yīng)，在臨床方面得到廣泛應(yīng)用。但iPSC誘導(dǎo)神經(jīng)元可能會殘留一部分未分化的細(xì)胞，并且iPSC誘導(dǎo)需要外來基因參與，這可能致使腫瘤產(chǎn)生，存在一定風(fēng)險。為了克服這些問題，研究人員開始探索從成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化獲得多巴胺神經(jīng)元來移植治療PD。
在通過直接轉(zhuǎn)分化制備誘導(dǎo)DA神經(jīng)元的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分化方向主要是由內(nèi)源性遺傳通路和表觀遺傳修飾來控制的。特定神經(jīng)元的成熟與分化，如多巴胺神經(jīng)元，涉及了一系列復(fù)雜有序的基因表達(dá)和調(diào)控。體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的分化過程主要有四個階段：1、胚胎干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Lmx1a/b、Ngn2、En1/2、Nurr1和Pitx3等的協(xié)同作用下被誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞。2、神經(jīng)干細(xì)胞中基因進(jìn)行特異性表達(dá)，進(jìn)一步分化為多巴胺前體細(xì)胞。3、生長發(fā)育生成早期的未成熟的多巴胺神經(jīng)元。4、轉(zhuǎn)錄因子作用于多巴胺神經(jīng)元特異性酪氨酸羥化酶（TH）和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）基因的表達(dá)，促使多巴胺神經(jīng)元成熟。
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之后研究人員基于遺傳譜系示蹤技術(shù)，了解到神經(jīng)元分化過程中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前已開發(fā)出多種方法將成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為DA神經(jīng)元。直接轉(zhuǎn)分化獲得神經(jīng)元主要是通過基因組DNA的表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位以及抑制和刺激關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因來實(shí)現(xiàn)的。目前主要方法有以下四種：1、過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。2、基于RNA的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。3、轉(zhuǎn)錄因子與小分子化合物或其他物理因素結(jié)合共同作用。4、基于蛋白質(zhì)的表觀遺傳修飾誘導(dǎo)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）和人源成纖維細(xì)胞是當(dāng)前研究人員最常用的啟動細(xì)胞。
2006年，研究人員首 次通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介質(zhì)過表達(dá)四個轉(zhuǎn)錄因子，即Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc，將小鼠的皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為誘導(dǎo)DA神經(jīng)元。2007年，Yamanaka和Thomson實(shí)驗(yàn)室的研究報告表明，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC or lentiviral- mediated介質(zhì)過表達(dá)OCT4, SOX2, NANOG,LIN28四個轉(zhuǎn)錄因子成功將人類成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為誘導(dǎo)DA神經(jīng)元。研究人員報告稱，由于成人大腦是由神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞分化而來的各種神經(jīng)元組成，內(nèi)部環(huán)境十分復(fù)雜，現(xiàn)有的模型并不能模擬出體內(nèi)的神經(jīng)元狀態(tài)，模型匹配性較差，研究結(jié)果十分不理想。
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另外，在直接轉(zhuǎn)分化的分子作用機(jī)制上，作者總結(jié)了轉(zhuǎn)錄因子的作用、轉(zhuǎn)錄組的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及細(xì)胞過渡不同階段的表觀遺傳修飾。目前可以通過過表達(dá)特定的轉(zhuǎn)錄因子、miRNA或者與化合物組合調(diào)節(jié)Wnt, Notch,和 JAK/STAT信號通路刺激或抑制遺傳表觀基因的表達(dá)來獲取誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元?？紤]到外源轉(zhuǎn)錄因子基因可能會整合到宿主細(xì)胞的基因組中，誘導(dǎo)基因突變，研究人員表示以后的直接轉(zhuǎn)分化可以利用episomal質(zhì)粒取代病毒載體來表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子，無需經(jīng)過轉(zhuǎn)基因整合。此外，使用RNA、miRNA、蛋白質(zhì)或者小分子化合物來實(shí)現(xiàn)直接轉(zhuǎn)分化獲取多巴胺神經(jīng)元也是一種安全方法。
雖然直接轉(zhuǎn)分化不需要經(jīng)過多能干細(xì)胞狀態(tài)，不會有腫瘤形成的風(fēng)險，在神經(jīng)退行性疾病的藥物篩選和移植治療方面具有巨大潛力，但就目前而言，直接轉(zhuǎn)分化效率低下，移植后細(xì)胞存活率低，在實(shí)際研究應(yīng)用中仍具有一定困難。對此，作者表示，隨著對分子機(jī)制和信號通路的更加深入的了解，未來將會開發(fā)出更高效的直接轉(zhuǎn)分化方法和細(xì)胞分離純化技術(shù)，以制備大量的誘導(dǎo)神經(jīng)元和多巴胺神經(jīng)元，這些神經(jīng)元更接近其自然狀態(tài)，為臨床治療PD和其他神經(jīng)退行性疾病研究提供充足的神經(jīng)細(xì)胞模型。
寧波易賽騰生物科技有限公司 李福云編譯
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8515543/
