神經(jīng)元分化，是指祖細胞通過有絲分裂產(chǎn)生神經(jīng)元的過程，該過程由一系列轉(zhuǎn)錄因子（TFs）調(diào)節(jié)。這些TFs調(diào)節(jié)神經(jīng)元末端效應(yīng)基因的表達，這些基因可以調(diào)控神經(jīng)元功能，例如神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道以及附加TFs。TFs必須駕馭復(fù)雜的染色質(zhì)圖譜，才能結(jié)合適當(dāng)?shù)脑鰪娮哟龠M或抑制基因表達。但多數(shù)情況下，在神經(jīng)元分化和成熟過程中，TFs表達下調(diào)，末端效應(yīng)基因的表達卻能保持穩(wěn)定。那么關(guān)鍵TFs的短暫表達是如何維持基因轉(zhuǎn)錄？由于目前無法大規(guī)模地準(zhǔn)確量化TFs基因組間的相互作用，這方面的研究進展緩慢。
2016年12月21日，Rhee教授及其同事在《神經(jīng)元》雜志中發(fā)表了一篇論文，文章表明通過分析染色質(zhì)可及性，并利用TFs結(jié)合位點的高分辨率映射可將胚胎干細胞（ESCs）逐步分化為下運動神經(jīng)元。研究人員在一個可控制的體外系統(tǒng)再現(xiàn)了發(fā)育過程中TFs的動態(tài)表達，其中Isl1和Lhx3是成熟神經(jīng)元效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄所必需的轉(zhuǎn)錄因子，但Lhx3表達水平下調(diào)，并不改變末端效應(yīng)基因的表達水平。ESCs在TFs的作用下先分化為表達 Isl1 和 Lhx3 的新生運動神經(jīng)元，然后成熟為保留 Isl1 表達但Lhx3 表達水平下調(diào)的下運動神經(jīng)元。
Rhee教授等研究人員采用染色質(zhì)開放性測序技術(shù)（ATAC-seq）、通過轉(zhuǎn)座子插入探測基因組的納米探針技術(shù)以及組蛋白H3K27的染色質(zhì)免疫沉淀測序技術(shù)（ChIP-seq）檢測ESCs分化過程中染色質(zhì)的可及性。他們觀察到，基因表達的變化相對較小, 但在新生和成熟的下運動神經(jīng)元分化過程之間存在非?；钴S的活性增強子。
那么這些只有一小段可訪問性的增強子的作用是什么？研究發(fā)現(xiàn)，Isl1和Lhx3以一種十分少見的方式來確保運動神經(jīng)元分化期間基因穩(wěn)定表達。在新生的運動神經(jīng)元中，Isl1首先與Lhx3形成臨時異源二聚體，與末端神經(jīng)元效應(yīng)基因非?？拷乃矔r增強子結(jié)合。隨后，由于Lhx3在神經(jīng)元成熟期間被下調(diào)，Isl1被釋放與相同神經(jīng)元效應(yīng)基因中新位點的Onecut1相結(jié)合（圖1A）。Isl1分別與早期和成熟增強子結(jié)合的這種中繼作用，確保效應(yīng)基因持續(xù)表達，該產(chǎn)物對成熟神經(jīng)元功能至關(guān)重要。相比之下，Ngn2在分化開始時短暫表達，通用神經(jīng)元識別必要的、與Isl1異源二聚體共享很少的位點進行結(jié)合，這表明它獨立工作激活另一組神經(jīng)元分化所需的基因。
在接下來的實驗中，Rhee 等人研究了早期和成熟增強子在人體內(nèi)是否具有時間特異性。研究人員準(zhǔn)備了一組人工增強子，在胚胎雞脊髓運動神經(jīng)元分化過程中控制GFP的表達。實驗結(jié)果表明，早期增強子在電穿孔后 24 小時內(nèi)促進產(chǎn)生 GFP，但無法在 48 小時內(nèi)維持 GFP的表達，而成熟增強子直到電穿孔后 48 小時才促進GFP表達水平上調(diào)。在與內(nèi)源性神經(jīng)元基因類似的結(jié)構(gòu)中，與早期和成熟增強子結(jié)合的報告基因在運動神經(jīng)元分化過程中持續(xù)促進GFP的表達。使用 CRISPR/Cas9 引導(dǎo)去除與 Isl1 和運動神經(jīng)元基因 Hb9 相關(guān)的早期和成熟增強子，在ESCs的運動神經(jīng)元分化中進一步驗證了這一階段增強子的時間特異性。
Isl1 從早期增強子到成熟增強子的逐步轉(zhuǎn)移是如何發(fā)生的呢？Rhee教授稱Isl1 轉(zhuǎn)移是通過競爭性結(jié)合發(fā)生的，其中 Lhx3 與 Onecut1 競爭與Isl1 結(jié)合，Isl1轉(zhuǎn)移到 Onecut1 可能是由于 Lhx3 在神經(jīng)元成熟時表達水平下調(diào)。有趣的是，Isl1主要與Lhx3 或 Onecut1相互作用，在此之前Lhx3和Onecut1已經(jīng)與它們的增強子結(jié)合，與Isl1結(jié)合之后激活相關(guān)基因。這項成果表明基因可以通過 Onecut1 和 Lhx3 等因子啟動表達，隨后通過Isl1的競爭性轉(zhuǎn)移，激活并穩(wěn)定表達。這為基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)增加了另一個維度，同源“錨點”（例如 Lhx3 或 Onecut1）可誘導(dǎo)結(jié)合與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，激活并穩(wěn)定基因表達。
(A) 在誘導(dǎo)神經(jīng)元分化過程中，外源性應(yīng)用維甲酸 (RA)、平滑激動劑 (SAG) 和 g-分泌酶抑制劑 (DAPT) 促進胚胎干細胞 (ESCs) 在 6 天內(nèi)分化為下運動神經(jīng)元。在分化過程中，神經(jīng)元效應(yīng)器的表達由作用于早期瞬時增強子的 Isl1/Lhx3 異二聚體激活表達，然后下調(diào) Lhx3 并將 Isl1 轉(zhuǎn)移到 Onecut1 結(jié)合成熟的增強子上維持表達。
(B)神經(jīng)元分化通過編程強制表達轉(zhuǎn)錄因子,在 48 小時內(nèi)將 ESCs分化為新生運動神經(jīng)元—— Lhx3、Isl1 和 Ngn2.Lhx3/Isl1 與早期增強子結(jié)合抑制增殖基因的表達，隨后轉(zhuǎn)移到成熟增強子與 Onecut 和 Ebf 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促進神經(jīng)元效應(yīng)基因表達。
新生的運動神經(jīng)元也可以通過直接編程ESCs分化得到，該方法通過強制表達 Isl1 和 Lhx3 以及 Ngn2，使神經(jīng)元效應(yīng)基因在 48 小時內(nèi)持續(xù)表達。
與 ESCs的逐步分化相比，同一類TFs如何在染色質(zhì)可及性和可用輔助因子不一致的情況下誘導(dǎo)效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄？Velasco教授及其同事分析了 Ngn2、Lhx3 與Isl1 結(jié)合過程中動力學(xué)原理及其在運動神經(jīng)元分化中開始 48 小時內(nèi)對轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)行為的影響。值得注意的是，增強子的整體作用邏輯也適用于直接編程運動神經(jīng)元，但稍有不同。Velasco 教授使用 ChIP-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量與Lhx3/Isl1 異二聚體結(jié)合的早期增強子，這些增強子與祖基因相關(guān)，而不是與神經(jīng)元效應(yīng)基因相關(guān)。此外，隨著早期增強子與Lhx3/Isl1之間相互作用促進基因表達的能力慢慢減弱，染色質(zhì)狀態(tài)受限制程度越來越高。隨后，Lhx3/Isl1與神經(jīng)元功能相關(guān)的末端效應(yīng)基因上的成熟增強子相結(jié)合，這些成熟增強子與Lhx3/Isl1之間相互作用促進基因表達。該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄因子在兩步過程中抑制祖細胞特征并促進神經(jīng)元分化。
Velasco教授等研究人員表明，在定向分化的條件下，Isl1 在晚期增強子處與 Lhx3 和 Onecut 相互作用（圖 1B），這些對比觀察結(jié)果與 Rhee 等人提出的競爭性結(jié)合模型情況不符。可能是由于直接分化過程中Isl1/Lhx3突然和持續(xù)的表達，或者是它缺乏外源性 RA-Shh 和 Notch 抑制誘導(dǎo)的分化程序，Isl1/Lhx3 可以訪問在ESCs誘導(dǎo)分化過程中不采用的結(jié)合位點。此外，如果Isl1表達過量并保持 Lhx3表達水平，則 Isl1 與 Onecut1 或 Lhx3 的競爭性結(jié)合可能無關(guān)緊要，Isl1 和 Lhx3可同時與成熟的增強子結(jié)合。直接分化過程中TFs的受控表達確實為研究人員提供了了解每個TFs獨立作用的機會。
通過敲除 Lhx3 和 Isl1，Velasco 等研究人員揭示 Ngn2促進了One-cut和EbfTFs 的后續(xù)表達。此外，如果 Lhx3/Isl1在沒有Ngn2 的情況下表達，它們向晚期增強子轉(zhuǎn)移的能力會嚴(yán)重降低。這闡明了 Ngn2 和 Isl1/Lhx3 分別與兩組互斥增強子初始結(jié)合后，如何最終匯聚在成熟增強子上，從而形成基因調(diào)控的前饋控制系統(tǒng)。這兩項研究都說明了增強子在細胞進行有絲分裂形成神經(jīng)元過程中的重要性。
利用前饋TFs系統(tǒng)按次序分程調(diào)節(jié)基因表達是否具有生物學(xué)價值？在分化過程中，運動神經(jīng)元亞型分化需要維持一般神經(jīng)元基因表達和激活細化神經(jīng)元亞型的特定基因表達，如離子通道表達以控制尖峰頻率。早期增強子的短暫結(jié)合可能會觸發(fā)一系列TFs，每個TFs都與瞬時增強子結(jié)合以產(chǎn)生下一組繼續(xù)細化基因表達的TFs。隨著這種前饋過程的進行，中繼增強子可以穩(wěn)定神經(jīng)元亞型之間的基因表達。在成熟神經(jīng)元中持續(xù)使用瞬時增強子將極大地加快細胞重編程和細胞替代療法的研究進程。由于這些神經(jīng)元模型在臨床和研究環(huán)境中的效用，研究人體內(nèi)環(huán)境與運動神經(jīng)元逐步或直接分化后最終狀態(tài)之間的聯(lián)系則至關(guān)重要。這些研究為有絲分裂后基因的表達和細胞分化過程中染色質(zhì)景觀的重組所必需的機制提供了相對可靠的結(jié)論，也為繼續(xù)深入研究提供了可能性。
寧波易賽騰生物科技有限公司 李福云編譯
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Transcription Factor Hand-offs “Enhance” Motor Neuron Differentiation - ScienceDirect
